pcr技术原理 pcr扩增技术 | 28百科知识网-pg麻将胡了模拟器

2024-10-0800:20:05综合百科0

1、聚合酶链式反应(pcr)

聚合酶链式反应(pcr,polymerase chain reaction)是一种体外扩增dna的技术。通过dna聚合酶的催化作用,pcr利用特定引物从母链dna开始复制,添加dntp、mg2 及其他扩增因子,并经过变性、退火、延伸等步骤,最终生成与母链互补的dna子链。这种方法可以迅速、特异性地扩增任何目标dna。

图1. pcr扩增过程

2、热启动pcr

在传统pcr中,扩增反应通常会在混合物配置完成后立即开始,这可能导致非特异性扩增。热启动pcr技术通过在反应初期引入“热启动”阶段来解决这一问题。在高温(通常高于90 ℃)下,酶修饰物被释放,激活dna聚合酶。具体的激活条件取决于dna聚合酶及其修饰物的特性。该技术主要利用抗体、亲合配体或化学修饰物来抑制dna聚合酶的活性,在常温下配置反应体系时,保证了pcr反应的特异性不受影响。

图2. 基于抗体的热启动pcr技术

3、逆转录pcr

逆转录pcr(rt-pcr)是一种从mrna反转录生成cdna并以此为模板进行扩增的实验方法。流程包括提取细胞或组织中的总rna,使用oligo(dt)引物,通过逆转录酶合成cdna,然后用cdna进行pcr扩增,从而检测基因表达或获取目标基因。

注:oligo(dt)是由少于20个脱氧胸苷酸连接而成的核苷酸链,它特异性地结合mrna的poly(a)尾部,使逆转录酶只能逆转录含有poly(a)尾的mrna。

图3. 逆转录pcr的基本原理

4、荧光定量pcr

荧光定量pcr(rt-qpcr)是在pcr反应体系中加入荧光标记,通过实时监测荧光信号的变化来分析pcr进程。主要的qpcr技术包括荧光染料法(如sybr green i)和探针法(如taqman)。染料法使用过量的sybr荧光染料,该染料特异性地与dna双链结合并发射荧光信号。探针法则使用taqman探针,报告荧光基团在探针完整时被淬灭基团吸收,而pcr扩增过程中,探针被降解,荧光信号释放,使荧光信号与pcr产物的形成同步。

图4. 荧光染料法的工作原理

图5. 探针法的工作原理

5、巢式pcr

巢式pcr(nested pcr)利用两对引物进行两轮pcr扩增,第二轮扩增产物才是目标基因片段。第一对引物(外引物)进行初步扩增,若有非特异性扩增产物,第二对引物(内引物)仅识别并扩增特异性区域,从而提高了pcr的特异性。此方法的优点在于能从有限的起始dna中获得足量的目标产物。

图6. 巢式pcr的原理

6、降落pcr

降落pcr(touchdown pcr)通过调整pcr循环中的退火温度,提高反应的特异性。最初的几个循环使用比引物tm值高几度的退火温度,这有助于减少非特异性扩增。在随后的循环中,退火温度逐渐降低到最佳温度,以增加目标基因的含量,并在剩余循环中维持此温度,从而优化pcr产物的特异性和产量。

图7. 降落pcr的工作流程

注:通过在较高温度开始,并逐步降低到最佳退火温度(黑色曲线),这种pcr方法提升了反应特异性(黄色曲线),目标扩增子的产量(绿色曲线)也得到了提高。

7、直接pcr

直接pcr允许直接从样品中扩增目标dna,无需经过核酸分离和纯化。方法包括直接法和裂解法。直接法是将样本直接加入pcr混合液中进行扩增;裂解法则是将样本放入裂解液中,释放dna后取裂解上清液进行pcr。此方法简化了实验流程,减少了操作时间,并避免了纯化过程中的dna损失。

推荐使用具有高合成能力的dna聚合酶,以应对细胞碎片、蛋白质、脂质和多糖等潜在抑制剂。高合成能力的聚合酶能在这些条件下工作,并从未纯化的样本中扩增微量dna。

图8. 直接pcr示意图

8、重叠延伸pcr

重叠延伸pcr(soe pcr)使用互补末端的引物,使pcr产物形成重叠链,并在后续扩增中将不同来源的片段重叠拼接。这项技术广泛应用于构建融合基因和基因定点突变。

图9. 重叠延伸pcr用于构建融合基因的原理

图10. 重叠延伸pcr用于基因定点突变的原理

9、反向pcr

反向pcr(inverse pcr,ipcr)通过使用反向互补引物扩增目标dna片段两侧未知序列。该技术最初用于确定邻近未知区域的序列,常用于研究基因启动子序列、致癌性染色体重排及病毒基因整合等。反向pcr流程包括对模板进行限制性酶切和连接,连接后的dna片段用于反向pcr扩增,生成的扩增子将包含已知序列的邻近区域。

图11. 使用反向pcr扩增和鉴定邻近未知序列

10、数字pcr

数字pcr(dpcr)是一种绝对定量核酸的方法。相比光度法和实时荧光定量pcr(rt-qpcr),数字pcr通过将稀释后的核酸溶液分散到微反应器或微滴中,每个反应器中核酸模板数少于或等于1个,经过pcr循环后,有模板的反应器发出荧光信号,无模板的反应器则无信号。基于此方法,可以精确计算核酸浓度,并应用于基因表达、拷贝数检测、低频等位基因辨别、病毒滴定及二代测序文库绝对定量等。

图12. 数字pcr的基本流程

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